Prinzipien von Quenched Fluorescence (QF)

Quenched Fluorescence (QF) – auf Deutsch auch als Fluoreszenzlöschung bezeichnet – ist ein grundlegender photophysikalischer Vorgang, der eine entscheidende Rolle in der modernen Spektroskopie, Messtechnik und molekularen Analyse spielt. Die QF-Technologie ist zu einem unverzichtbaren Werkzeug für die Echtzeit-Sauerstoffmessung in der Erdgasverarbeitung, der Bioprozesstechnik, der Umweltüberwachung und der medizinischen Diagnostik geworden. Ihre Attraktivität liegt in ihrer Präzision, Selektivität und Stabilität – die ohne bewegliche Teile, chemische Verbrauchsmaterialien oder Querempfindlichkeit erreicht wird, wie sie bei älteren Sensorkonzepten häufig anzutreffen waren.

Dieser Artikel untersucht die physikalischen Grundlagen der QF-Technologie, ihre Nachweismethoden und praktischen Umsetzungen. Außerdem geht er darauf ein, wie QF im Vergleich zu anderen für Gasmessungen genutzten optischen und elektrochemischen Ansätzen dasteht.

Wenn ein Molekül Lichtenergie absorbiert, gehen seine Elektronen in einen höheren Energiezustand über- Dieser Vorgang wird als Anregung bezeichnet. Wenn das Molekül in seinen Grundzustand zurückkehrt, gibt es einen Teil dieser absorbierten Energie als Licht im sichtbaren oder nahe am sichtbaren Bereich frei. Dieses wieder ausgesendete Licht wird als Fluoreszenz bezeichnet.

Fluoreszenz tritt nur bei Molekülen mit besonderen Elektronenstrukturen auf. Oft sind dies organische Farbstoffe oder Übergangsmetallkomplexe. Das ausgesendete Licht hat üblicherweise eine längere Wellenlänge (geringere Energie) als das absorbierte Licht, da es während der Relaxation zu einem internen Energieverlust kommt. Die Differenz zwischen der absorbierten und emittierten Wellenlänge wird als Stokes-Verschiebung bezeichnet. Sie ist ein zentrales Konzept für auf Fluoreszenz basierende Messverfahren.

Fluoreszenzlöschung tritt auf, wenn in dem fluoreszierenden Molekül, das nach seiner Anregung Licht aussendet, etwas eine Veränderung verursacht. Der „Quencher“ – üblicherweise ein anderes Molekül – tritt mit dem angeregten Zustand des Fluorophors in Wechselwirkung und versetzt ihn dadurch in die Lage, Energie strahlungslos (durch Kollisionen oder Energietransfer) statt durch Emittieren eines Photons zu verlieren.

Quenchen kann durch mehrere Mechanismen erfolgen. Zu ihnen gehören:

• Dynamisches Quenchen (Stoßlöschung): Energie wird auf den Quencher übertragen, während Moleküle im angeregten Zustand kollidieren.
• Statisches Quenchen: Ein nichtfluoreszierender Komplex zwischen dem Fluorophor und dem Quencher wird bereits vor der Anregung ausgebildet.
• Energietransfer und Elektronentransfer: Energie oder Elektronen werden zwischen Spezies ausgetauscht und verringern dadurch die Fluoreszenzausbeute.

In vielen industriellen Sensoranwendungen dient Sauerstoff (O₂) als Quencher. Da Sauerstoff die angeregten Zustände bestimmter Farbstoffe wirksam deaktiviert, können Veränderungen bei Fluoreszenzintensität oder -lebensdauer direkt mit der Sauerstoffkonzentration im umgebenden Medium in Beziehung gesetzt werden.

Das quantitative Verhältnis zwischen der gelöschten Fluoreszenz und der Konzentration des Quenchers wird durch die Stern-Volmer-Gleichung ausgedrückt:

I₀ / I = 1 + K_SV[Q]

Oder entsprechend mit der Fluoreszenzlebensdauer:

τ₀ / τ = 1 + K_SV[Q]

Mit:

• I₀ und τ₀ gleich der Fluoreszenzintensität und Fluoreszenzlebensdauer ohne Quencher.
• I und τ gleich den entsprechenden Werten in Anwesenheit des Quenchers.
• K_SV gleich der Stern-Volmer-Konstante.
• [Q] gleich der Konzentration des Quenchers.

Die Linearität dieses Verhältnisses bildet die Grundlage für quantitative Messungen. Durch Überwachen der Veränderung von Fluoreszenzintensität oder -lebensdauer kann die Konzentration des Quenchers – beispielsweise gelöster oder gasförmiger Sauerstoff – genau bestimmt werden.

Optische Sauerstoffsensoren beruhen auf dem Prinzip, dass Sauerstoffmoleküle die Fluoreszenz eines angeregten Farbstoffs löschen („quenchen“) können. Die Messung wird üblicherweise mit den folgenden Schritten ausgeführt:

1. Anregung: Eine Lichtquelle, oft eine blaue LED (≈470 nm), beleuchtet einen Fluoreszenzfarbstoff, der in einer sauerstoffdurchlässigen Matrix immobilisiert ist.
2. Emission: Wenn kein Sauerstoff vorhanden ist, sendet der Farbstoff eine Fluoreszenz im hellroten oder im nahen Infrarotbereich aus.
3. Quenchen: Wenn Sauerstoff vorhanden ist, kollidiert er mit den angeregten Molekülen des Farbstoffs und überträgt Energie strahlungsfrei, wodurch die Fluoreszenzintensität verringert und eine Verschiebung der Wellenlänge verursacht wird.
4. Detektion: Das ausgesendete Licht wird über einen Lichtwellenleiter zu einem Photodetektor zurückgeführt, wo die Phasenverschiebung gemessen wird.
5. Berechnung: Das System berechnet die Sauerstoffkonzentration mit der aus der Stern-Volmer-Gleichung abgeleiteten Kalibrierkonstante.

Dieser Zyklus ermöglicht es, Sauerstoff in Echtzeit zu messen, ohne dabei Sauerstoff zu verbrauchen. Die Messung bietet eine bemerkenswerte Empfindlichkeit – von Konzentrationen im ppm-Bereich (parts per million) bis in den Prozent-Bereich.

Zur Quantifizierung der Fluoreszenzlöschung kommen hauptsächlich zwei Techniken zum Einsatz: die intensitätsbasierte Bestimmung sowie die Bestimmung anhand von Lebensdauer oder Phasenverschiebung.

• Intensitätsbasierte Bestimmung: In der Anfangszeit optischer Sauerstoffsensoren wurde aus der Abnahme der Fluoreszenzintensität im Verhältnis zu einer Referenz die Sauerstoffkonzentration abgeleitet. Diese Methode ist allerdings relativ empfindlich gegenüber Schwankungen der Lichtquelle, der Alterung des Farbstoffs und der optischen Ausrichtung.
• Bestimmung anhand von Lebensdauer oder Phasenverschiebung: Moderne QF-Sensoren verwenden phasenmodulierte Lichtquellen, um damit die Zeitverzögerung (Phasenverschiebung) zwischen dem Anregungslicht und der emittierten Fluoreszenz zu messen. Da die Fluoreszenzlebensdauer eine spezifische molekulare Eigenschaft ist, wird diese Methode erheblich weniger von Umgebungsbedingungen oder Änderungen der Lichtintensität beeinträchtigt.

Die Fluoreszenzlebensdauer nimmt mit steigender Sauerstoffkonzentration üblicherweise vom Mikrosekunden- in den Nanosekundenbereich ab. Dieser phasenbasierte Ansatz ermöglicht kurze Ansprechzeiten, Langzeitstabilität und eine hohe Driftfestigkeit – entscheidende Vorteile in industriellen Anwendungen.

Fluoreszenzlöschung ist im Wesentlichen ein Vorgang des Energietransfers durch Kollisionen zwischen angeregten Fluorophoren und Quencher-Molekülen. Beim Quenchen mit Sauerstoff wird diese Wechselwirkung durch die Diffusionskinetik und die Orbitalüberlappung der Moleküle bestimmt.

Wie stark die Löschwirkung ist, hängt unter anderem von folgenden Faktoren ab:

• Diffusionsgeschwindigkeit des Sauerstoffs durch die Sensormatrix
• Temperatur (sie beeinflusst Diffusion und Kollisionsfrequenz)
• Viskosität und Struktur des Wirtsmaterials
• Lebensdauer im angeregten Zustand des Fluorophors

Durch eine genaue Abstimmung von Zusammensetzung und Porosität des Polymerfilms können Ingenieure die Diffusionsgeschwindigkeit von Sauerstoff kontrollieren sowie Ansprechzeit und Empfindlichkeit optimieren.

Ein typischer QF-Sauerstoffsensor besteht aus drei Hauptkomponenten:

• Fluoreszierende Sensorschicht (Farbstoffmatrix): Ein festes Polymer oder ein Sol-Gel-Film, dotiert mit einem sauerstoffempfindlichen Farbstoff (z. B. einem Ruthenium- oder Platinkomplex); der Farbstoff wird entsprechend seiner Photostabilität und spezifischen Quench-Eigenschaften ausgewählt.
• Lichtwellenleiter oder Fenster: Führt das Anregungslicht von der Quelle zur Sensorspitze und die ausgesendete Fluoreszenz zurück zum Detektor; die Verwendung von Lichtwellenleitern ermöglicht eingriffsfreie Messungen über größere Entfernungen.
• Detektions- und Elektronikmodul: Enthält die Lichtquelle, die Photodiode oder den Photomultiplier sowie die Elektronik für die Signalverarbeitung zur Bestimmung der Veränderungen von Phase oder Intensität.

Diese Komponenten sind oft in robust ausgeführte Sensoren für industrielle Anwendungen integriert, die bei Prozessgasleistungen, Sonden für Umweltmessungen oder Bioreaktoren zum Einsatz kommen, das grundlegende Messprinzip bleibt aber immer gleich.

Ein wichtiges Argument für die verstärkte Einführung von QF-Systemen bei industriellen Messungen ist ihre optische Einfachheit und chemische Robustheit im Vergleich zu traditionellen Technologien. Die QF-Technologie bietet mehrere Vorteile:

• Selektivität für Sauerstoff: Fluoreszenzlöschung ist selektiv gegenüber Sauerstoff und weist vernachlässigbare Querempfindlichkeiten gegenüber Wasserdampf, Schwefelwasserstoff und Kohlendioxid auf – Spezies, die oft einen störenden Einfluss auf elektrochemische Sensoren haben.
• Konzentrationen im ppm-Bereich (part-per-million)
• Langzeitstabilität: Optische Systeme enthalten keine Reagenzien oder Elektrolyten, die aufgebraucht werden. Dank stabiler Farbstoffmatrizen und Festkörperkomponenten sind die Kalibrierintervalle lang und der Wartungsaufwand ist minimal.
• Schnelle und kontinuierliche Messung: Da es sich beim Quenchen um einen unmittelbaren Kollisionsvorgang handelt, sprechen Fluoreszenzsensoren innerhalb von Millisekunden auf Änderungen der Sauerstoffkonzentration an. Dies ermöglicht die Echtzeitüberwachung dynamischer Prozesse.
• Sicherheit und Kompatibilität: Da diese Sensoren optisch und ohne Kontakt der Probe zu reaktiven Elementen arbeiten, können sie Sauerstoff sicher in Kohlenwasserstoffströmen, entzündlichen Gasen oder biologischen Medien messen, ohne dass ein Entzündungs- oder Kontaminationsrisiko besteht.

Für Sauerstoffanalysen kommen noch mehrere weitere Technologien zum Einsatz, von denen jede ihre spezifischen Stärken und Einschränkungen hat. Der Vergleich zwischen ihnen gibt Hinweise darauf, wann die QF-Technologie den größten Nutzen bietet.

• Arbeitsprinzip: optische Bestimmung der Stoßlöschung des angeregten Farbstoffs
• Typischer Bereich: ppm bis %
• Stärken: schnell, selektiv, Messung ohne Materialverbrauch, geringe Drift
• Einschränkungen: relativ hohe Anfangskosten des Sensors

• Arbeitsprinzip: misst den Sauerstoff-Partialdruck mittels einer elektrochemischen Reaktion an einem Feststoffelektolyt aus Zirkoniumdioxid
• Typischer Bereich: %
• Stärken: hochgenau bei erhöhten Temperaturen; robust für raue industrielle Umgebungen
• Einschränkungen: benötigt ein Heizelement; langsameres Ansprechen bei niedrigen Temperaturen; begrenzt auf %-Bereich

• Arbeitsprinzip: chemische Reaktion zwischen Sauerstoff und Elektrode in einem Elektrolyt erzeugt einen Strom
• Typischer Bereich: ppm bis %
• Stärken: niedrige Kosten, einfache Elektronik
• Einschränkungen: Zelle muss routinemäßig ausgetauscht werden; empfindlich gegenüber H₂S und Feuchtigkeit

• Arbeitsprinzip: Sauerstoff wird von einem Magnetfeld angezogen; gemessen wird das magnetische Drehmoment
• Typischer Bereich: %
• Stärken: genau für hohe Konzentrationen
• Einschränkungen: nicht geeignet für H₂S oder Kohlenwasserstoffströme; beschränkt auf %-Bereich

• Arbeitsprinzip: Trennung und Nachweis von Sauerstoff mit Trägergas und Säule
• Typischer Bereich: ppm bis %
• Stärken: hohe analytische Präzision
• Einschränkungen: langsam (mehrere Minuten pro Probe), hoher Wartungsaufwand

• Arbeitsprinzip:abstimmbarer Diodenlaser auf einer bestimmten Wellenlänge, bei der Sauerstoff Licht absorbiert
• Typischer Bereich: %
• Stärken: berührungslose optische Messung; kann für In-situ- oder extraktive Messungen verwendet werden
• Einschränkungen: Interferenz mit anderen Hintergrundgasen ist möglich; Staub und Aerosole können sich auf Spiegeln und Fenstern ablagern

Im Vergleich zu anderen Methoden der Sauerstoffmessung bietet die QF-Technologie eine einzigartige Kombination aus Geschwindigkeit, Stabilität und Widerstandsfähigkeit in chemisch aggressiven oder sehr feuchten Umgebungen.

Sowohl die Diffusion von Sauerstoff durch die Sensorschicht als auch die Fluoreszenzlebensdauer des Farbstoffs sind temperaturabhängig. Deshalb verfügen die meisten Systeme über eine automatische Temperaturkompensation, oft unter Verwendung eines ebenfalls integrierten Thermistors. Für Gasphasenmessungen ist eventuell auch eine Druckkompensation erforderlich.

Nach mehreren Betriebsjahren kann sich bei Sensorfilmen allmählich Photobleichung bemerkbar machen, oder an ihrer Oberfläche können sich Ablagerungen bilden. Mit modernen Materialien ist eine Sensorlebensdauer von mehr als drei bis fünf Jahren jedoch durchaus üblich.

Für die Kalibrierung wird der Sensor üblicherweise bekannten Sauerstoffkonzentrationen ausgesetzt (z. B. Stickstoff für den Nullpunktabgleich und Luft für die Messspanne). Dank ihrer Stabilität brauchen auf Fluoreszenz basierende Sensoren im Vergleich zu ihren elektrochemischen Alternativen nur selten rekalibriert zu werden.

Neue Sensormatrizen – beispielsweise Sol-Gel-Hybridmaterialien, Siliziumdioxid-Nanopartikel und fluorierte Polymere – erweitern den Betriebsbereich und die Umgebungstoleranz von QF-Sensoren. Diese Materialien verbessern die Stabilität des Farbstoffs und verringern die Photobleichung.

Die jüngsten Fortschritte bei LWL-Netzwerken und in der miniaturisierten Photonik ermöglichen Multiparameter-Sensoren, die in einer Sonde Sauerstoff-, pH- und Temperaturmessung kombinieren.

Bei der Forschung in Biologie und Mikrofluidik arbeitet die Fluoreszenz-Lebensdauermikroskopie (Fluorescence-Lifetime Imaging Microscopy, FLIM) nach den gleichen Prinzipien, um räumliche Darstellungen von Sauerstoff in mikroskopisch kleinen Maßstäben zu erzeugen. Damit können für Zellverhalten und Stoffwechselprozesse kritische Gradienten sichtbar gemacht werden.

• Erdgasverarbeitung – Wenn Sauerstoff in Erdgasströme gelangt, kann dies Korrosion verursachen, explosive Gemische erzeugen und die Produktqualität beeinträchtigen. Optische Fluoreszenzsensoren stellen eine kontinuierliche, genaue Sauerstoffmessung von der Gewinnung bis zur Verteilung bereit und unterstützen Betreiber so bei der Aufrechterhaltung der Systemintegrität.
• Energiewende – Bei Anwendungen zur CO₂-Abscheidung, -Nutzung und -Speicherung (Carbon Capture, Utilization and Storage, CCUS) ist Sauerstoff eine Verunreinigung, die entfernt werden muss. Biogas/Biomethan-Anwendungen beruhen auf anaerober Vergärung. Um eventuelle Undichtigkeiten im Fermenter zu erkennen, muss deshalb der Sauerstoff gemessen werden. Für eine gute Qualität des Biomethan-Endprodukts muss der darin enthaltene Sauerstoff im niedrigen ppm-Bereich liegen. Auch bei Anwendungen für grünen Wasserstoff werden Sauerstoffmessungen benötigt.
• Bioprozesstechnik und Fermentation – In der Biotechnologie ist die Regelung von gelöstem Sauerstoff entscheidend für den Zellstoffwechsel. Fluoreszenzsensoren werden häufig in Fermentern eingesetzt, um Probleme im Zusammenhang mit Drift und Sterilisation bei elektrochemischen Sonden zu vermeiden.
• Umwelt- und Wasserüberwachung – Mittels Fluoreszenzlöschung wird der gelöste Sauerstoff (Dissolved Oxygen, DO) in natürlichen Gewässern und im Abwasser gemessen. Diese Sensoren bieten Haltbarkeit und geringen Wartungsaufwand für Langzeiteinsätze.
• Medizin und Life Sciences – Von der Sauerstoffversorgung des Gewebes bis zu mikrofluidischen Systemen ermöglichen Fluoreszenzsensoren ein nichtinvasives optisches Mapping in kleinen Volumina. Dies ist eine unverzichtbare Voraussetzung für physiologische und pharmakologische Studien.
• Anwendungen in Luft-/Raumfahrt und Energie – Dank ihrer Unempfindlichkeit gegenüber elektromagnetischen Störungen werden mit LWL-Technik ausgestattete QF-Systeme für Prüfungen in Luft- und Raumfahrt, in der Verbrennungsforschung sowie zur Überwachung von Brennstoffzellen eingesetzt, wenn es auf Genauigkeit und Reaktionsschnelligkeit ankommt.

1. Berlman, I. B. Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2. Auflage, Science Direct.
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